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概述

单细胞转录组测序: 是在单细胞水平对mRNA进行逆转录和PCR扩增,使用高通量测序手段,对单个细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析,它可以解决传统RNA定量技术在早期备胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在样本量极低或细胞异质性的问题,主要用于细胞分子机制中细胞异质性研究、以及样本量少而无法进行常规高通量测序等。

应用领域

极微量样品的表达分析(单个细胞)、极微量样品的表达分析(单个细胞)、肿瘤细胞异质性研究、免疫细胞群研究、干细胞分化研究。

单细胞转录因组测序技术流程

样本要求

1、细胞分离:由合作方完成单细胞分离

2、样品类型:活体新鲜完整细胞;不适于经固定、染色等处理的样本

3、样品体积:在显微镜或其他设备辅助下分离,得到的单细胞样本体积以不高于0.5μl为宜

4、送样量:建议重复单细胞样本个数不小于5个。

其它要求

1、直接使用公司提供的0.2mL平盖PCR管作为采集管,管盖标注编号;细胞样本需采用缓冲液洗涤;裂解液避免反复冻融。注意避免起泡;

2、操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下(如冰上)。 样本采集管需要用Parafilm封口膜缠绕封口,装入PCR管盒,橡皮筋固定,再装入自封袋,-80℃暂存,大体积干冰运输;防止液体状态下管身颠倒使细胞附于采样管内壁上部;

3、送样量:单细胞基因组扩增,建议重复单细胞样本个数不小于5个;

4、细胞采样后,请置于96孔管盒中,避免采样管倾倒,尽快寄送,若需保存请置于-80℃。

案例:

单细胞转录组绘制人类植入前胚胎和胚胎干细胞转录组图谱分析

Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells


研究材料

选取90个早期胚胎的单细胞以及34个人类胚胎干细胞系(hESCs)单细胞。

研究结果

 测定人体细胞的基因表达对于理解控制人胚胎发育的基因调控网络至关重要,通过对124个细胞进行的单细胞转录组测序,构建了完整的人类胚胎发育基因表达图谱,检测出了22,687个母源表达基因,在国际上首次成功分离了囊胚阶段胚胎中的三种细胞(上胚层细胞、原始内胚层细胞及滋养外胚层细胞),进一步发现了一批新的细胞分化相关的标志基因。在人类植入前胚胎中发现了2733种全新的lncRNA,其中许多lncRNA表达具有发育阶段特异性,很可能参与了植入前胚胎发育过程中的细胞命运决定。

参考文献

Yan, L., Yang, M., Guo, H., Yang, L., Wu, J., Li, R., ... & Huang, J. (2013). Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nature structural & molecular biology, 20(9), 1131-1139.

常见问题


Q 常见的单细胞分选方法及优缺点?

Q 单细胞转录组加入ERCC spike-in control作用。

ERCC 是一种最常用的RNA spike-ins,一共有92个250-2000bp长度的人造的转录本序列,作为外源参照,在细胞RNA 预扩增之前加入一定浓度ERCC,可以评估建库质量和校正基因定量。ERCC需要按照根据样品的细胞中转录组的量确认加入的比例。目前经过测试的1:100000的稀释比例效果较好。

Q 从肿瘤组织样本中分选单细胞的方法。

将肿瘤组织切下后,经机械破碎,酶解,形成单细胞悬浮液,然后用流式细胞仪进行分选。

从肿瘤组织样本中分选单细胞的方法(Anoop P, et al. Science, 2014)