圣庭生物-ShengTingGroup

概述

真菌基因组测序 是指利用二代或三代测序技术,通过高深度测序和生物信息分析,获得真菌基因组的序列、编码和变异等信息。依照是否有近缘参考基因组和不同的信息分析策略,分为真菌de novo 和真菌重测序。

产品方向

根据不同的研究目的和需求,细菌基因组测序可以细分为4个产品

真菌基因组de novo测序技术流程

真菌基因组重测序技术流程

样本要求

样本类型:基因组DNA

样本需求量:小片段文库≥2 μg ,2~3 kb大片段文库 ≥20 μg , 5~6 kb大片段文库 ≥20 μg ,10kb文库≥30 μg,20 kb和40 kb大片段文库 ≥ 60 μg

样本浓度:小片段文库≥30 ng/μL,大片段文库≥50 ng/μL

样本纯度:OD260/280=1.8~2.0

测序平台

HiSeq PE150

测序策略

350bp文库≥100X

案例1:

终极腐霉全基因组测序

Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythiumultimum reveals original pathogenicity mechanismsand effector repertoire


研究材料

终极腐霉DNA进行全基因组测序。

研究结果

通过对P.ultimum 进行全基因组测序,基因组大小为42.8M,编码15290个基因,并且与相关的疫霉属物种(包括马铃薯枯萎病原体致病疫霉)具有广泛的序列相似性和同源性,运用比较基因组学方法主要包括共线性分析、基因家族分析和毒力基因分析,将P.ultimum 与Phytophthora 菌进行比较分析,发现二者序列总体具有很高的相似度,也存在基因重排现象(如下图)。对其致病机理进行研究发现P.ultimum 编码了一些特异性的蛋白参与致病过程对其致病机理进行研究发现P.ultimum 编码了一些特异性的蛋白参与致病过程。

参考文献

Buell C, et al. Genome sequence of the necrotrophic plant athogen Pythiumultimum reveals original pathogenicity echanisms and effector repertoire. Genome Biol. 2010. 11:R73.

常见问题


Q 真菌基因组测序主要有哪些产品?

根据不同的研究目的与需求,细菌基因组测序可以细分为如下3个产品:

真菌框架图:采用小片段建库(500bp),HiSeq深度测序与初步的基因组组装策略,性价比高,满足真菌基因组研究基本需求。

真菌精细图:采用大片段(2Kb+5Kb)加小片段建库,HiSeq与MiSeq深度测序以及反复优化的基因组组装策略,是目前研究真菌基因组的主流产品。

真菌重测序:针对已知基因组的真菌,采用小片段建库,HiSeq深度测序,后续分析不依赖于组装,关注基因组变异情况(包括SNP与InDel等),是群体研究的首选。

Q 微生物全基因组测序的高级分析有哪些?

1、Mummer共线性分析:选取多个近缘物种的参考序列,运用软件将前期组装得到的基因组序列与近缘物种进行排序比对,从而得到基因组之间的相似性及共线性关系的信息。

2、Blast共线性分析:能够实现比较两段核酸或者蛋白序列之间的同源性的功能,它能够快速的找到两段序列之间的同源序列并对比对区域进行打分以确定同源性的高低。主要是利用BLAST软件,进行组装结果与近缘物种参考基因组比对,统计其基因组中相似匹配的位置。

3、Cor-Pan基因:选取多个近缘物种的相关基因蛋白序列,通过比较基因中蛋白质的序列,找出物种间共有和独有的基因数目,构建出几个基因组间的Core和Pan基因。

4、基因家族分析:选取多个近缘物种的相关基因蛋白序列,通过比较基因中蛋白质的序列,找基因中相近的序列,基因组家族是多个基因组中共同祖先的一组基因,往往具有相似的结构和功能,因此也可以作为未知基因功能的依据,也可以为基因进化历史提供线索。三代真菌精细图为何要进行Survey?

真菌种类繁多,从十几Mb的酵母,到上百Mb的大型真菌,其基因组大小和复杂程度具有很大的差异,进而影响真菌的测序数据量和组装难度。特别是对于三代测序为基础的真菌精细图,由于测序成本高,为避免数据浪费,通过Survey来预先确定真菌的大小,选择合适的测序量,显得非常重要。与此同时,通过Survey还能够预先排查基因组污染,提前进行风险预警,减少污染可能造成的损失。

Q 三代真菌精细图中小片段文库的作用是什么?

三代真菌精细图中,小片段文库主要有两个作用,除了前面提到过的Survey功能,预估基因组大小并排除污染之外,还可以用于组装完成后的验证,进一步确认基因组组装的质量。

Q 三代真菌精细图为何选择70X测序深度?

数据量对于三代真菌精细图组装的影响,此前已经有文献进行过详细的评估工作,大约70X的三代测序数据,可以使三代真菌精细图组装效果达到一个临界值,以合理的测序成本获得最佳的组装效果。

Q 真菌基因组如何进行编码基因预测?

与原核生物相比,真核生物编码基因结构更为复杂。基因的可变剪切机制,外显子和内含子的结构,使得我们难以用单一软件准确预测真菌的编码基因。为提升真菌基因组编码基因预测的准确性,我们使用了de novo预测、同源预测、EST预测等多种途径进行编码基因预测,并对结果进行整合,以获得尽可能可靠的最终注释结果。